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        離心機在休止細胞反應實驗中的運用

        發布時間:2021-12-17 10:49:31??????點擊:

          休止細胞反應實驗的順利進行需要用到離心機。

          因為在細胞制備階段細菌收集過程中離心分離提取細胞。

          休止細胞又稱靜息細胞,把培養液中各種營養物質和生長因子洗去后懸浮在生理鹽水中培養一段時間,以消耗內源營養物質,呈饑餓狀態的細胞,在研究微生物的生理生化及新陳代謝中有廣泛的應用。它的主要特性就是細胞雖然處于休眠狀態,不進行生長繁殖,但仍含有各種酶系,具有氧化和發酵能力,在適宜條件下可再恢復生長。另外休止細胞反應專一性強,可以提高底物轉化率,不易染雜菌,可以減少產物對菌體生長及酶合成的抑制。

          休止細胞的制備:

          (1)菌株的活化

          用接種環將實驗所需的E. coli CVCC 249接種到已滅菌的固體斜面培養基上,37 ℃恒溫箱培養18—24 h。

          (2)菌株的獲得

          用接種環在斜面培養基上刮取適量菌轉接至液體三角瓶中,恒溫振蕩培養箱37 ℃振蕩培養至OD > 1.(大約1.4左右)。

          (3)細菌的收集

          將培養好的細胞菌液放入離心管中,離心機4500 rpm 離心收集細胞,棄去上清培養液,用生理鹽水洗滌,洗去培養液,之后離心機4500 rpm離心收集細胞,重復洗滌三次至上清液透明,棄去上清液。

          (4)菌懸液的制備

          將離心后的細胞用pH 為7.0 的磷酸緩沖液定量至25 mL,吹懸混勻,為以后實驗使用。

          (5)休止細胞的制備

          菌懸液放置在4 ℃條件下放置72 h 后,在37 ℃培養4—8 h,休止細胞制備完成,放在4 ℃冰箱中備用。

          脫氫酶活性的測定:

          (1) 在5 mL的離心管中加入1 mL反應底物,并根據底物設置不同的濃度(同一濃度不同底物對細胞脫氫酶活性影響,如表1所示。不同稀釋度的各種底物對細菌脫氫酶降活性影響,我們做了三種底物的實驗,分別是乙酸鈉,琥珀酸鈉和檸檬酸鈉,如表2,表3和表4所示)。

          (2) 加入制備的休止細胞0.4 mL,用等體積的5%甲醛處理30 min滅活的細胞懸液作為對照。在加入細胞之前一定注意將休止細胞搖勻后再加。

          (3) 加入MTT 40 μL ,震蕩搖勻,此時的溶液應呈黃色,恒溫培養箱中37 ℃避光保溫2 h。

          (4) 加入二甲基亞砜1.3 mL,震蕩混勻后,37 ℃保溫30min ,此時溶液呈深藍紫色。

          (5) 加入PBS (pH 7.0)1.5 mL,振蕩混勻。

          (6) 722分光光度計測510 nm的OD ,每個樣品濃度至少要進行三次實驗,變異系數(coefficient of variation ,CV) 小于5%。

          酶活性是指酶催化一定化學反應的能力。任何一個酶都有催化一定底物進行特定反應的能力,但是酶的催化能力的測定實際上只能通過測定酶催化反應速度來實現。酶催化反應速度愈大,酶活力愈高,反之活力愈低。而酶促反應速度可用單位時間內、單位體積中底物的減少量或產物的增加量來表示。另外,在研究酶促反應時,底物一般是過量的,因此一般測定產物的增加量較合適些。由于酶催化反應速度受溫度、pH、離子強度及底物等諸多因素的影響,我們所謂的酶活性都是只在特定的系統和條件下測到的反應速度,因此在測定酶活性時,一定要注明這些特定的條件。即使同樣的酶,甚至用同樣的測定方法和同樣的單位定義,由于條件稍有不同,也會使測到的酶活性難以比較。因此,要比較各篇文獻報道或者不同牌號制劑的某種酶活性時,必須注意它們的單位定義和測定系統及條件,千萬不能盲目比較。

          與酶活性相關的另一個概念是“比活”,食指單位重量的蛋白質中所含的某種酶的催化活性,是純度量度,單位為u/mg。比活越高則酶越純。


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